铂类抗肿瘤复合物罗森伯格发现50周年

FrancoM.Muggia,AndreaBonetti,JamesD.Hoeschele,MarcelRozencweig,andStephenB.Howell

引言

临床肿瘤学杂志近日聚焦了过去50年间发生的剧变，使最初高致死性的睾丸生殖细胞肿瘤成为几乎可以治愈的肿瘤1。在临床上这一里程碑式的成就皆归功于罗森伯格于年在他的实验中发现了顺铂2。在这一发现的50周年之际，能让我们想起以下一些肿瘤治疗中的关键方面：（1）罗森伯格的生平和他留下的宝贵财富，包括组织了将近四分之一的铂类的会议，并且将肿瘤生物学进展纳入到更高的治疗策略中；（2）减轻顺铂毒性反应的临床研究；（3）寻找低毒的顺铂类似物导致了卡铂的发现；（4）奥沙利铂和铂类药物治疗谱的扩大；（5）正在进行中的关于铂类耐药的多方面的研究。铂类抗肿瘤复合物的研发历程，即使在这个靶向治疗的时代，也能为我们将来的经验性发现提供了一个视角。

罗森伯格的生平和成就

罗森伯格（年到年；图1，罗森伯格博士，教授，密歇根州立大学，年）年生于纽约布鲁克林。从布鲁克林学院获得大学学位后，他追随其他天才的脚步来到了纽约大学，在此获得了物理学硕士（年）和博士（年）学位。他的博士导师保罗·卡拉曼曾经师从伟大的思想家—爱因斯坦，罗森伯格也十分荣幸的成为徒孙。年至年拿到纽约大学数学博士后学位后，他以高级物理研究学家的身份加入西屋电气公司，并且在年以研究科学家-项目负责人的身份返回纽约大学，期间开展他自己的政府课题资助的生物物理学研究。年，他加入密歇根州立大学与后来在此工作的莱罗伊教授（-）。参与创建生物物理学系，并且在年至年间一直在化学系任职，直至年退休。年，他在密歇根州立大学创建了巴罗斯研究所，并且在这里指导了很多的实验项目直至82岁去世。年，就是在这个实验室，他发现了顺铂和其生物学活性，顺铂的发现是整个团队协作与努力的结果，每个人对这个发现都有重大的贡献。促成这一耗时5年的发现的原因有三个方面：（1）研究者发现细菌细胞分裂被抑制但不抑制细胞生长；（2）执着而艰难的寻找潜在成因；（3）最终发现顺铂潜在的生物学活性。这一发现是偶然的，即正常大肠杆菌（附图1，左侧）一持续流动的细胞暴露在铂电极产生的电场中时，到倍正常长度的的长丝状链产生（附图1，右侧）2-4。从此对介子的效应开展了深入研究，最终以顺铂的发现和证明其潜在的抗肿瘤作用为结束。罗森伯格团队系统的评价了许多临床试验变量作为潜在诱因的作用，最后他们集中在一种假说：在电解作用产生的（NH4）2PtCl6是始动因素。在另一个意外发现中，罗森伯格团队的LorettaVanCamp观察到，储存液（NH4）2PtCl6在细菌培养基中发生了光化学改变，并且变得更有效3。这一变化的产物证明就是Cis-[Pt（NH3）2Cl4]。随后通过与NCI化疗项目合作，在体外实验，Cis-[Pt（NH3）2Cl4]和Cis-[Pt（NH3）2Cl2]都能抑制细胞分裂，接下来在体内试验验证，最终证实Cis-[Pt（NH3）2Cl2]的抗肿瘤效果更强。我们引用罗森伯格对于这一发现的讲话：“历时两年的工作，这些化合物最终被证实是顺铂或其类似物。这个化合物在年被首次被合成，著名的佩伦氯化物，维尔纳对它们结构的解释奠定了配位化学的基础。因此，顺铂真正拥有了辉煌的历史，我们的工作第一次展示了这类化合物具有重要的生物学活性”4p11。根据在细菌DNA上看到的效应，罗森伯格通过与CGordon指导的NCI及NCI化疗项目（后来重组作为癌症治疗部门）合作尽快探索其抗肿瘤活性。顺铂的国家应用编号是No：。起初的评价是通过NCI小鼠肿瘤筛查，主要基于致癌物诱导的小鼠白血病。这些研究证明顺铂具有抗多种实验性肿瘤的活性。在罗森一直的督促下（引致Carter，在一个NCI化疗项目接触过，在年后期，几乎每周都能听到罗森说“我的药怎么样了？”临床研发也被快速的跟进，并于年开始临床研究。I期临床试验受到顺铂用量达到40mg/m2后发生了几例严重肾功能损害的困扰，同时还有几乎普遍出现的呕吐和偶尔的耳毒性。接下来的研究发现更积极的水化有助于缓解肾毒性等后使研究才得以继续进行5。更重要的是，在几乎致死的来源于睾丸的生殖细胞瘤治疗中，顺铂产生了空前的治愈效果并且迅速的加入到治愈性的联合方案-更有说服力的是在Einhorn领导的前瞻性研究中证明1，7。EveWitshaw发现顺铂在治疗晚期卵巢上皮细胞肿瘤中有很好的活性8。年，NCI癌症治疗评价项目为医生总结了顺铂的治疗潜力，以及面临的挑战，除了肾衰竭、耳毒性，还有明显的恶心呕吐和周围神经毒性等副作用9。年，在NCI癌症治疗评价项目主导下，在华盛顿召开的会议总结了顺铂作为抗癌药物的大体情况，FDA批准顺铂用于睾丸癌，卵巢癌和膀胱癌，NCI癌症治疗评价项目9授予Bristol实验室（也就是后来的BMS）合作研发协议奖。自此，顺铂更多的适应症被批准，并且很多新观点的加入使铂类作为抗癌药物有了更多的进展。罗森伯格倡导合作精神集中化学家、基础科学家和临床医生的力量一起，几乎每4年举行一次国际铂配合物研讨会来更新进展（号称铂类奥林匹克），包括最近两次由这篇文章的3个合著者组织的会议（在意大利的维罗纳举办，7年11月29日至12月2日，年10月11日至14日），意在共同促进铂类药物的发展。这些会议和研究的重点列在附表1并且总结在刊物11-20和其他的综述里21。

解决顺铂毒性的策略

除了呕吐和全面的止吐药物发展（在线附件）22-25，顺铂的肾脏毒性，随着使用甘露醇或者袢利尿剂等强制性利尿，由起初的不可预知变得更加可控。如EstebanCvitkovic在意大利米兰的马里奥内格里研究所所做的对狗的研究所示的结论，他最后在临床应用在纽约纪念斯凯龙特林癌症中心的睾丸癌的患者26。I期试验中，在没有肾脏安全性迹象的前提下，广泛的研究试验流程允许安全剂量逐渐上升到每3周40mg/m2（附录）。先期使用一些药物的治疗，包括其他铂类，环孢菌素和氨基糖苷类抗生素等使患者容易发生顺铂诱导的肾毒性27。当利特斯特28在老鼠模型中证明氯尿症可以减少肾毒性后，这项干预措施被应用到患者后能够接受更高的安全剂量，(从～mg/m2，纪念斯凯龙特林癌症中心29，30和美国癌症研究所31。应用高渗透盐水，在年轻生殖细胞肿瘤、骨肉瘤或者其他的儿童实体肿瘤患者中，mg/m2的顺铂持续应用4周期有更好的肾脏安全性记录。在保持氯尿症的同时，大剂量顺铂的方案扩展到其他适应症，例如卵巢癌32。然而，尽管避免了肾毒性，但这些方案耐受性不好，通过增加顺铂剂量强度提高疗效受到了限制，因而变得没有意义。电解质不平衡——主要是钾和镁的丢失，来自于顺铂的肾小管毒性，这些被用来避免肾损害的甘露醇或呋塞米类利尿剂而加重，在缺乏有效的止吐药物的情况下，长时间的呕吐也同样加重了这个问题，芬森研究所关于于低镁血症及低钾血症的研究证明了顺铂对于锯齿动物及随后的人类的影响33。严重的低镁反过来通过降低骨对甲状旁腺的反应度进而导致低钙血症。有机阳离子转运体2（OCT2）抑制剂在对抗顺铂的肾毒性及耳毒性方面有重要作用。西咪替丁预防了糖尿病及蛋白尿，以及顺铂在肾脏的皮质细胞及耳蜗的毛细胞，血管纹和柯氏器等的累积34-36。在先天听力受损的成人及儿童人群，尤其期望减少耳毒性。OCT2表达在背根神经节细胞，是奥沙利铂及顺铂集聚的部位，同时伴随西咪替丁能保护老鼠暴露在寒冷或机械引起疼痛的情况，说明OCT2在奥沙利铂引起的神经毒性方面有重要作用37。但是很少人类肿瘤细胞表达OCT2，假设肿瘤形成相关的表观遗传学改变38-41，针对OCT2的靶向治疗需要进一步研究，有可能在不牺牲疗效的前提下减轻顺铂引起的毒性。

随着联合使用紫杉醇，神经毒性成为了顺铂主要的累积性毒性（相当于奥沙利铂的部分程度）。感觉神经病变使顺铂联合紫衫的使用变得更加复杂，然而卡铂通常是低的神经毒性，与紫杉醇联合引起的临床问题通常是短暂的42。很遗憾，一些神经保护药物和神经再生的一些办法因为没有显示出充分的可重复的有效性而没有获得监督部门的批准。

寻找低毒的类似物：卡铂

批准后不久，首要任务是这种低毒类类似物是否保留了顺铂的活性，在约翰逊马泰与伦敦，英国的癌症研究协会间的一项工业-学术探索和发展合作在对卡铂(cisdiammine-[1,1-cyclobutanedicarboxylato]platinum[II])的鉴定方面取得了突破。通过对百时美施贵宝进行的在复治女性卵巢癌中能够明确的提高治疗指数年获得美国食品及药物行政管理部门的批准25。卡铂上的残基环丁烷羧酸铂比氯化物更加稳定，有更低的毒性，可预见的药代动力学，安全有效43。

与顺铂相比，卡铂根本上减少了肾毒性，以及更低的神经毒性。正如Harrap通过雪貂模型试验的预示，卡铂44较另外一种较低肾脏毒性药物异丙铂相比，有明显低的致吐性42，然而，卡铂可以预见的药物动力学使随后的临床开发变得容易。在对成人及儿童试验中，血小板减少是剂量限制毒性，Egorin及Calvert等将其用在儿童及成人药物代谢动力学效应的确证指标45，46,47。百时美施贵宝公司的Canetta等将基于肾功能的卡铂用量的计算公式，在初治及化疗过的患者中得到广泛验证48。尽管顺铂及卡铂对DNA的加合物是相同的，当暴露到卡铂后，加合物的形成率要较顺铂慢10倍，它需要20-40倍高浓度的卡铂才能产生和顺铂相同数量的加合物49。当患者有合并症，出于安全原因不能应用顺铂的情况下，卡铂具有更大的接受度，由于卡铂具有可预见的安全性，逐渐缩小了顺铂作为首先铂类药物的情形50。比如，随着同样有百时美施贵宝紫杉醇的应用，紫杉醇联合卡铂在多种肿瘤中进行广泛的探索，例如非小细胞肺癌，妇科肿瘤及胃食管来源肿瘤，经常联合放疗。令人奇怪的，卡铂联合紫杉醇能够加速从卡铂的剂量限制性血液学毒性中恢复（主要是血小板减少及一定程度的中性粒细胞减少症）51。

一些质疑的声音出现，卡铂很好的耐受性是否以牺牲顺铂的疗效为代价？52然而，在一项卵巢癌的III期试验中，卡铂作为一线治疗的疗效优于顺铂53，卡铂已经成复发铂类敏感性患者的选择19。在其他恶性肿瘤中，卡铂对于顺铂缺乏治疗优势成为了争论主题54，但除了胚胎细胞瘤以外1，54。需要解决争论的比较性研究还没有进行，在肿瘤的治疗中，卡铂逐渐成为被广泛应用的铂类药物。顺铂仍然优先用于胚胎细胞癌1，辅助治疗非小细胞肺癌55以及一线治疗进展的膀胱56及头颈部肿瘤57，同时联合放疗58应用于局部进展期的子宫颈癌，有时通过特殊方式给药，比如腹腔灌注59。然而，卡铂被证明与放疗联合用于食管癌的放化疗是有效的60。目前正在进行通过腹腔给药途径比较卡铂与顺铂为基础的方案治疗卵巢癌的III期临床研究。

减轻顺铂毒性的途径还包括在脂质体包裹顺铂以及一定数量在其他国家批准的具有与顺铂相似的活性低肾毒性的其他铂类。除此之外，NCI61寻找并确定有独特的临床前特点的其他铂，将会在下一部分和附录中介绍。

扩大顺铂治疗谱：奥沙利铂

虽然卡铂已成为首要的第二代铂类药物，奥沙利铂脱颖而出成为最广泛使用的第三代铂类药物。奥沙利铂及相关的1,2-二氨基复合物最初是由Kidani等人62在日本合成，并因为对顺铂耐药的肿瘤有活性而进一步开发。最终，Mathé等人63进行了结直肠癌临床前和临床观察，之后法国的deGramont等人64所开发的具有重要意义的奥沙利铂和氟尿嘧啶的联合方案，预示着这类常见肿瘤以奥沙利铂作为基础方案取得了显著的临床进展，以及后来适用于胃肠道来源的其它癌症。奥沙利铂，顺铂（和卡铂），在DNA链内鸟嘌呤（5GG）类似DNA位点上形成加合物，但具有不同的载体配体：顺铂为二氨，奥沙利铂为大分子的二氨基环己烷（图2）。对细胞效应和DNA修复蛋白对加合物的识别的主要差异已经出现;最显著差异是加合物与HMG域蛋白质（即HMGB1，LEF-1，TBP和Hubf）66-68如何相互作用的。因此，顺铂和奥沙利铂与DNA加合物具有不同结合亲和力的HMG结构域蛋白可能有助于其各自的细胞效应69。具体来说，HMGB1抑制应用顺铂后加合物的跨损伤修复的程度强于较的较应用奥沙利铂后，更大程度上阻止损伤合成70。因此,在结肠直肠癌71中增加表达的HMGB1或许可以解释其对顺铂的内在耐药性，而不奥沙利铂72,73。同理,有缺陷的错配修复(MMR)途径与顺铂的耐药性相关，与奥沙利铂无关74。对应用顺铂后加合物的无效的跨损伤合成产生新合成的DNA，由错配修复除去可促进细胞死亡。因此,失去MMR导致顺铂耐药75，无论错配修复完善与否，对奥沙利铂而言没有不同的旁路，奥沙利铂加合物及有缺陷的细胞没有差异。而且，从一开始，在以氟尿嘧啶为基础的方案中加入奥沙利铂已经使进展期转移性结直肠癌患者得到明显受益；“在对进展期结直肠癌治疗中已取得非常可喜的结果，”16p。然而顺铂与氟尿嘧啶联合治疗结直肠癌中的结果是令人失望的76。联合治疗主要对转移性和可切除的直肠癌明显改善预后77。此外，胃肠道肿瘤学家从奥沙利联合氟尿嘧啶方案的精通导致扩大适应症，作为抗胰腺，胃及胃食管癌化疗的骨架78,79,80。这些临床成果说明了化学和生物因素的复杂性，很可能导致某种癌症对特定铂类敏感，以及是什么造成铂类药物的敏感或抗药性，这也是我们最后的话题。

铂类敏感性及逆转耐药：实验室与临床发现

在过去的三十年间，进行了大量的研究来确定顺铂原发和获得性耐药的原因。根据不同的细胞系和肿瘤类型，大量的机制得到了阐述。这些作用机制主要可以分为药物摄取的减少，细胞内硫醇和金属硫蛋白的中和以及DNA损伤的耐受性81-83，这些机制的阐明有助于寻求干扰某一具体机制的策略。相关研究表明，卡铂和顺铂间存在着绝对的交叉耐药，而与奥沙利铂间的差别较大84。

相反，对顺铂和/或卡铂敏感性预测最可靠的生物标物是BRCA1或BRCA2等位基因失活突变。携带BRCA1或BRCA2有害突变的肿瘤缺乏同源性基因修复的能力（同源重组），是铂类-DNA加合物剪切过程中双链断裂的无差错修复所必须。有特殊BRCA1突变乳腺组织的条件小鼠模型复制了人类基底细胞型（三阴）乳腺癌的特征85。这些肿瘤可被顺铂根除，提示了同源重组的不可逆失活是决定顺铂敏感性的重要因素86,87。临床研究证实，BRCA突变携带88的卵巢癌对铂类和对DNA损伤剂更加敏感，大部分BRCA1突变的乳腺癌，在接受了顺铂单药新辅助治疗后获得了病理学完全缓解89。相反，BRCA基因的其他突变使功能性BRCA蛋白恢复后就发生了铂类的耐药90。在同源重组缺失时对其他DNA损伤剂和多聚合酶（PARP）抑制剂更加敏感，在BRCA功能缺失时将导致合成致死性91-93。最近美国食品和药物管理局的批准了奥拉帕尼以及其他PARP抑制剂的研发，进而促进了用来确定同源重组缺失的诊断性测试，确定哪些患者最有可能从PARP抑制剂以及铂类中受益，。实际上，复杂的DNA修复逐渐出现曙光，在我们研究卵巢癌中，对PARP抑制剂耐药的患者保留对铂类的敏感性，发生同源重组缺失的患者中高达40%的患者对这两种药物不能表现出预期的交叉敏感性（例如，BRCA1突变携带）94。

其他影响铂类药物敏感性的DNA修复机制包括核苷酸切除修复，以及在前面部分提及的错配修复状态。核苷酸切除修复蛋白，特别是ERCC1(切除修复交叉互补基因)，自19世纪80年代末已经知道可识别和修复因顺铂1,2-内d（GPG）交联导致的螺旋扭曲95-97。核苷酸切除修复蛋白，错配修复缺失和铂类耐药间的关系在实验室评进行了广泛评估。HMG蛋白早就在结直肠癌中因导致奥沙利铂对比顺铂或卡铂的不同疗效被提及。抑制Wee-1激酶能够克服p53突变的卵巢癌对铂类的耐药，在其他上皮肿瘤处于早期的临床研究中，强调了G2细胞周期检测点在修复致死性铂类损伤中的重要作用，并强调了铂类耐药的一种p53依赖机制的可能性98。

最后，大多数基于临床前期模型，顺铂和卡铂的耐药一直与肿瘤细胞药物摄取减少相关。它们的极性有助于限制透过脂膜的扩散，以及脂质体形成的稳定性。酵母菌中丢失高亲和力铜内流性转运蛋白1（CTR1）引起顺铂摄取减少，最终导致顺铂的耐药。在人和小鼠大量的后续研究证实哺乳动物细胞中最主要的铜转运蛋白CTR1，对于药物摄取和敏感性是一个重要决定性因素99-(图3)。在一些细胞类型中CTR1的缺失导致在体内外对顺铂的耐药，过表达两种铜外流性转运蛋白ATP7A和ATP76中任一种能够减少顺铂的聚集使细胞耐药。顺铂也非常明确的通过其他机制进入细胞内，例如通过主要在肝脏表达的OCT1和主要在肾脏表达的OCT2完成。这些转运子与奥沙利铂有更强的亲和力，与它们在结肠癌中出现一起，可以解释奥沙利铂能够应用在在这类疾病，与其他铂类药物形成对照释。如前所述，用OCT的底物西咪替丁治疗降低了DNA加合物的形成并可部分保护了顺铂的肾毒性37,38和奥沙利铂诱导的神经毒性36。细胞内的谷胱甘肽可以调节被转运的铂量，因为谷胱甘肽的增加可以降低铜离子浓度并提高CTR1的表达，这样也增加了铂类的转运（和在细胞系中谷胱甘肽介导铂类耐药数据的普遍解释相反）。

讨论

铂类对多种肿瘤均有活性，仍然是在肿瘤领域广泛应用的药物，正如此，在将来，他们仍将是多种肿瘤治疗的最佳方案，尤其是铂类药物能够治愈的肿瘤。不像其他针对特殊靶点的药物，关于铂类药物的敏感性与耐药性仍不确定；然而随着包括肿瘤细胞存活的基本规律在逐渐被披露。研究利用铂类药物特有的化学特性影响的细胞生物学来回答是否针对某些恶性细胞？包括强大的基因学，基因组学，分子和细胞生物学工具都可以应用，确定铂类药物与特异靶向药物及免疫策略间的合成致死性的相互作用，在个别患者可以导致彻底清除肿瘤的效应。重要的是，最近一些关于阳离子转运子的观点确实能够选择性保护正常组织，增强治疗指数。

到目前，对铂类药物耐药的不完全理解已经阻碍了对铂类药物获益的人群筛选的精准治疗，但是什么引起能够对铂类特殊的敏感，随着我们对HRD的理解，及应用依赖于条件性敲除p53及BRCA1的三阴性乳腺癌的鼠模型，始终对顺铂敏感已经变得很明朗。在90年代，大剂量的应用卡铂和自体骨髓或外周血干细胞的移植对铂类敏感的卵巢癌的阴性结果，以及在睾丸癌中变数，







































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