埃博拉病毒病的实验室诊断方法

本文原载于中华检验医学杂志年6期

埃博拉病毒病(Ebolavirusdisease，EVD)，既往称为埃博拉出血热(Ebolahemorrhagicfever，EHV)，病原体是埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)。作为中国首批援利医疗队队员，笔者有幸参与并负责了利比里亚的中国埃博拉治疗中心(EbolaTreatmentCenter，ETC)的EVD实验室诊断工作。在此，根据自身工作经验和文献复习，主要讨论了EVD的实验室诊断方法及其临床意义，并简要概述了实验室诊断流程中必须遵循的生物安全防护要点。

一、实验室诊断标准方法

确诊或排除EBOV感染的实验室标准检测方法有病原学和血清学检测。病原学检测包括检测病毒基因组的实时RT－PCR、检测病毒抗原的抗原捕获ELISA、检测活病毒的病毒培养与鉴定，血清学检测包括检测抗病毒IgM和IgG抗体的ELISA方法[1,2,3,4]。

EBOV属于生物危害程度最高的4级病原体，病毒培养与鉴定必须在生物安全4级实验室，因此，一般的临床病例均不做此项检测。相对于抗原和抗体，基因组检测更具有早期诊断和疫情控制优势：阳性结果可比抗原提前24～48h[2,5]；死亡病例的阳性检出率高于抗原或抗体[6]。上述优势使实时RT－PCR检测病毒基因组成为西非疫区唯一提供的EBOV实验室检查项目。

EBOV是丝状单股负链RNA病毒，基因组全长bp，7个线性排列结构的编码基因依次为3－NP－VP35－VP40－GP－VP30－VP24－L－5。实时RT－PCR通常针对EBOV特异性序列设计探针和引物，并通常以人核糖核酸酶P为阳性内对照，通过实时RT－PCR的循环阈值进行定性或定量检测。

二、待检者标本的采集、保存与转运

EBOV感染的发生缘于直接接触EVD患者的血液或体液，或者直接接触EVD患者感染性血液或体液染污的环境(如：脏衣物或床单)，并主要通过破损皮肤或黏膜传播[2,4,7]。已有的研究结果表明，1～10个EBOV就能感染接触者，EVD患者血液中EBOV滴度可高达到拷贝/ml以上，因此，即使是纳升级微滴大小的污染血液均具有高度传染性[4,8,9,10,11]。可见，在标本采集、保存和转运流程中，必须重视生物安全防护，具体措施与方案可遵循最近的文献报道[8]。

1．标本的采集、保存与转运要点：

标本类型主要有4类：静脉血、唾液、心脏血和活检皮肤。静脉血主要针对存活患者。血标本采集管应为塑料管[7]，因玻璃管更易残留RNA酶，导致EBOV病毒降解而出现假阴性结果。血浆标本首选抗凝剂为EDTA[7]，不可采用肝素，因肝素可强烈抑制DNA聚合酶活性而导致假阴性结果[12]。唾液标本可使用棉签采集口腔唾液方式获取，主要针对死亡病例、活着的但不易采集静脉血的婴幼儿和老弱患者。条件许可时，不建议采集存活患者的口腔棉签，因为无论是RT－PCR还是抗原或抗体检测，其灵敏度均低于血液标本，易导致漏诊而延误病情诊治与疫情控制。心脏血和活检皮肤的采集对象是死亡患者，包括未做过EBOV检测的EVD疑似病例和可能病例，以及疫情流行期间其他不明原因的死亡患者。心脏血主要用于即时确认患者的死亡病因，皮肤活检主要用于既往死亡患者的流行病学调查[13]。

此次西非疫区所在的ETC一般不具备检测EBOV的实验室，因此，均需要将采集的标本转运至指定的疫区所在EBOV检测实验室。样本转运箱必须使用符合UN标准的A类生物样本专用生物安全运输箱，至少有内层、中间层和外层共3层容器[2]：内层容器用于放置标本，其密封和防漏装置可将泄漏物质留滞于该层容器内；中间层具有防水和防漏功能，可防止内层标本泄漏和外部液体倒流入内层，避免标本与环境之间的相互污染；外层容器主要用于长途运输，如果是短途转运的话，可考虑省略此外包装，但应附有生物危害标志。标本可在室温条件下保存24h，如需更长时间，可在中间层放入制冷模块或冰盒，达到2～8℃条件[7,14]。

2．标本采集和转运的防护要点：

采血员必须穿戴个人防护装备，且其穿脱标准和流程与临床医护人员一致[15]。此外，采血员须穿戴第3层手套，并且，当采集不同患者标本时，必须手消毒和更换第3层手套，以保护采血员，防止不同患者之间的交叉感染[8]。标本转运关键是确保生物安全运输箱中间层和外层容器的外表面不能受到标本的污染。中国ETC在具体实施过程中，特色性地提出并遵循不触碰、严消毒的原则，在污染区和清洁区交界区设置了标本交接点[8]。在此交接点，采血员和标本交接员共同完成标本交接。其特点在于，采血员负责将装有标本的内层容器放入洁净的中间层容器，标本交接员负责将中间层容器放入外层容器。在整个放置过程中，由采血员用0.5%氯溶液依次喷洒中间层和内层容器的外表面，完毕后，标本交接员将运输箱放置于洁净区临时保存或及时转运[8]。

三、病原学和血清学检测结果的临床意义

1．RT－PCR确诊或排除EBOV感染的标准，以及EVD确诊病例的出院标准[3,16]：

疑似病例和可能病例首次阳性结果即可确认为确诊病例；若症状出现不足72h，阴性结果并不能排除EBOV感染；若72h后，EVD相关临床症状消失，阴性结果可排除EBOV感染。EVD确诊病例的出院或治愈标准必须是两次连续检测结果持续阴性，且2次采样至少间隔48h[3]。由上可见，病程72h是实验室诊断的一个关键时间节点，原因在于病程初期72h内，EBOV滴度可能达不到实时RT－PCR的最低检测限，甚至，个别患者可在症状出现10d左右才会有阳性结果[16]。

2．其他临床意义：

病毒滴度(拷贝/ml血清或血浆)与患者死亡率正相关：死亡病例显著高于存活病例(均值一般高2个数量级)，且通常持续增加[5,17,18]；病毒滴度拷贝/ml的患者死亡率仅33%，拷贝/ml的患者死亡率飙升至94%，二者具有显著差异(P＝0.)[17]。因此，有必要连续监测患者的病毒滴度，为临床治疗提供决策依据。

血清学检测结果表明，IgG或IgM抗体阳性结果提示预后较好，但大部分EVD死亡病例的检测结果呈阴性，提示患者未产生免疫应答[20]。如果患者对EBOV感染产生了免疫应答，通常在病程的第1周就能够检测到IgM抗体，IgG出现的时间通常略滞后于IgM，但可持续至少11年之久[18]。

四、实验室辅助检查项目的临床意义

EBOV感染所导致的电解质紊乱、多器官损害和功能衰竭是EVD患者死亡的主要原因，因此，上述检测项目可为EVD患者的病情评估和临床治疗提供十分重要的依据。EVD患者上述项目的典型检测结果主要包括白细胞减少症、血小板减少症、转氨酶增高、肾功能受损和凝血功能障碍[17,18,19]。

1．血常规：

病程初期通常表现为白细胞减少症，主要是淋巴细胞减少。疾病进展期白细胞总数可增高，主要是非成熟粒细胞增加，并有大量异常淋巴细胞。血小板减少症是EVD的主要特征，通常保持在50～×/L，减少程度与疾病严重程度及死亡危险性正相关，重症患者持续降低，直至死亡。

2．肝肾功能：

AST、ALT、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、血尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)和Cr增高，并显著高于EBOV阴性的发热患者，但峰值通常远低于其他病毒感染性疾病(如：甲肝病毒、HBV或黄热病)。血清AST、BUN和Cr持续高水平与患者死亡危险性正相关，血清ALT、ALP和总CO2则在死亡与存活病例间无显著区别。血清AST通常高于ALT，存活病例相差2～4倍，死亡病例可相差7～12倍。血清AST、ALT、ALP、BUN和Cr持续降低或恢复正常，总CO2正常或增加，提示患者已经处于恢复期。

3．电解质：

可出现严重的低钠血症、低钾血症、低镁血症、低钙血症等电解质紊乱症。低钾血症与患者的腹泻和呕吐严重程度相关，低钙血症是不良预后指标，死亡病例的血清钙通常1.5mmol/L。

4．凝血功能：

常出现凝血功能障碍，主要包括凝血酶原时间和部分凝血活酶时间延长，纤维蛋白降解产物增加，通常能够达到弥散性血管内凝血的诊断标准。重症病例和死亡病例的异常情况更为严重。

EBOV病原学和血清学是确诊或排除EVD的重要实验室依据，血常规和肝肾功能等辅助项目对于EVD患者的病情评估、个性化补液和采取有针对性的生命支持措施具有十分重要的临床意义。但是，由于EBOV的强致病性与易感性，在开展上述项目时，必须考虑生物安全防护问题。近年来发展极为迅速的POCT有可能在有限条件下最大限度地为EVD及其他急烈性传染病提供十分有价值的辅助诊断项目，但仍然需要进一步探讨其流程与生物安全性。

（参考文献：略）

本文编辑：武昱

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